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上旋齿蜗牛的检疫鉴定
作者:本馆    来源:浙江自然博物馆   发布时间:2017-12-22    点击数:     【字体:

作者:杨海芳(中国湿地博物馆)

   杨姗萍(福建农林大学)

   林俊宏(福建农林大学)

   王    沛(福建出入境检验检疫局)

   周卫川(福建出入境检验检疫局)

   (欢迎转载,须注明作者与来源(《自然博物》第4卷)

  【摘要】文章应用贝壳形态、软体解剖和分子生物学相结合的方法对福建出入境检验检疫局截获的一种蜗牛进行鉴定,结果表明该蜗牛为上旋齿蜗牛Helicodonta obvoluta(Müller,1774)。上旋齿蜗牛是国际上倍受关注的一种有害生物,该物种极易入侵新区,建立种群,危害农林作物,尤其是给园艺作物造成严重的经济损失。上旋齿蜗牛在国内尚无分布,加强检疫是防治该蜗牛最为经济有效的技术措施。


  【关键词】 上旋齿蜗牛;贝壳形态;软体解剖;分子特征;植物检疫

  上旋齿蜗牛Helicodonta obvoluta(Müller,1774),在分类上属于软体动物门Mollusca,腹足纲Gastropoda,柄眼目Stylommatophora,上旋齿蜗牛科Helicodontidae Kobelt,1904,上旋齿蜗牛属Helicodonta Férussac,1821,是一种具有重要检疫意义的危险性较大的有害生物。该物种遍及欧洲的大部分国家和地区,从西班牙西北部到塞尔维亚都有分布,包括法国、瑞士、列支敦士登、比利时、卢森堡、荷兰、德国中南部、奥地利、捷克、斯洛伐克、波兰、匈牙利、斯洛文尼亚、克罗地亚、意大利、波斯尼亚和黑塞哥维那、塞尔维亚等国家和地区(Gassies,1849;Kerney,1979;Maltz,2003)。这种蜗牛极易入侵新区,建立种群,严重危害农作物,给蔬菜、花卉、水果生产造成严重的经济损失。

  上旋齿蜗牛喜欢生活在温暖潮湿的菜园,在法国1 年繁殖一代,在波兰2 年繁殖一代(Maltz,2003)。该蜗牛主要取食作物的幼苗和生长期的嫩芽,导致缺苗断垄,降低产量,污染产品。该蜗牛不但直接危害作物,而且在其爬行过后留下白色黏液痕迹,大大降低了水果和蔬菜的商品价值。该蜗牛目前在中国大陆尚无分布,因此必须加强检疫,严防其入侵和危害。本文简要介绍该蜗牛的形态与分子生物学检测鉴定方法,供有关部门和检验检疫人员参考。

  1 材料和方法

  1.1 实验材料

  上旋齿蜗牛成螺贝壳和活体标本均由福建出入境检验检疫局从德国进境的废塑料中截获。贝壳标本保存于中国湿地博物馆,活体酒精浸泡标本保存于福建出入境检验检疫局国家质检总局软体动物检疫鉴定重点实验室(实验室冷藏标本编号:FJIQBC 0000 Q2)。

  1.2 实验方法

  1.2.1 形态学鉴定

  根据检验检疫行业标准《软体动物常规检疫规范(SN/T 3067 — 2011)》(Dillon,1984)的方法进行贝壳形态的观察和测量、生殖系统的解剖和描述。

  1.2.2 分子生物学鉴定

  1.2.2.1 基因组DNA 提取及PCR 扩增

  取上旋齿蜗牛腹足肌肉约 20 mg ,按照天根公司的TIANamp Genomic DNA 提取试剂盒说明书提取基因组总 DNA 。利用线粒体COI 基因通用引物(LCO 1490 : 5 '- ggtcaacaaatcataaagatattgg- 3 ';HCO 2198 : 5 '-taaacttcagggtgaccaaaaaatca- 3 ')进行 PCR 扩增(Vrijenhoek,1994),PCR 反应体系为100 ng/μL的DNA 模板2 μL,10 μ(mol)的上下游引物各1μL,2 ×PCRMaster Mix 10 μL,ddH 2 O 6 μL。PCR 反应扩增条件为94℃ 预变性5 min;94℃ 变性50 s;45℃ 退火30 s;72℃ 延伸50 s;35 个循环;最后72℃ 延伸10 min;4℃保存。PCR 产物用1% 的琼脂糖凝胶电泳检测,目标片段送上海生物工程技术有限公司进行双向测序。

  1.2.2.2 序列拼接与比对鉴定

  将双向测序结果用序列分析软件BioEditV. 7 .0(Hall,1999)进行序列的拼接和人工校对,并与 Genbank 已公布的上旋齿蜗牛的COI 基因序列进行比对鉴定。

图1 上旋齿蜗牛贝壳形态(左背面观、右腹面观)


  2 结果和分析

  2.1 形态学鉴定

  2.1.1 贝壳形态

  贝壳小型至中型,深棕色,螺旋部扁平,胚螺层光滑,壳顶略向下凹陷,有5 ~ 6 个略为凸起的螺层。贝壳表面通常覆盖长约1 mm 的毛刺, 成螺标本毛刺常脱落,仅留痕迹。壳口折叠呈圆三角形是其典型特征。口缘上下两侧均较平扁, 外唇白色外折,中部增厚形成腭牙或胼胝,在外观上中唇被折叠分成三个弯,内唇贴覆于体螺层上形成很薄的无色透明的胼胝部。脐孔开放, 宽大,可透视,呈同心圆。壳高5 ~ 7 mm,壳宽11~15 mm。其贝壳形态特征与以往的观察和描述基本一致(Maltz,2007;王沛,2014)(参见图1)。

  阿尔巴尼亚和黑山共和国的地理种群,贝壳通常较小,壳顶更为凹陷,各螺层增长更为迅速;毛刺短,约为其他种群的1/ 3;壳口更圆,内侧没有齿状突,外侧也没有相应的凹槽(Maltz, 2007;Welter-Schultes,2012)。

  2.1.2 软体形态

  腹足淡黄色,细短,颈部颜色较深。头部至腹足爬行时伸展长度可达23 ~32 mm,参见图2。

图2 上旋齿蜗牛螺体形态

  2.1.3 生殖系统

  阴茎鞘薄而透明,包被在阴茎与阴茎本体的表面。阴茎内分布几根粗的呈纵向排列的壁柱, 其中一根短而宽,形成一个纵向的槽。壁柱的前端呈垫状增厚,表面有大量的圆锥形小坑。在垫状增厚的壁柱背面有一个马鞍状突起,表面密布圆锥形的刺。这些结构形成了一个明显的瓣膜,能够明显区分阴茎的前端和末端。在瓣膜的后面,具有一个短小的分裂成两瓣的边缘。阴茎牵引肌从螺轴肌长出,插入阴茎本体末端。阴道细长,内侧平滑或布满不明显的纵向折叠。矢囊系统很特殊:无矢囊和恋矢,仅见黏液腺2支。受精囊卵圆形,受精囊柄中等长度、无分支。生殖系统特征也符合前人的鉴定标准(Shileyk,2005;王沛等,2014),参见图3。

图 3 上旋齿蜗牛生殖系统


  MG 黏液腺;P 阴茎;PR 阴茎牵引肌;PBC 受精囊柄;BC 受精囊;VD 输精管;V 边缘;PS 阴茎鞘;Pil 壁柱

  2.2分子生物学鉴定

  截获的德国蜗牛标本,经DNA 提取、PCR 扩增、双向测序、软件拼接和人工校对后,得到619 bp 序列,并上传至Genban k(登录号:KY 940217)。经与Genbank 已发表的上旋齿蜗牛(登录号:FJ 786473 . 1,KF 986835 . 1)线粒体COI 基因序列片段比对,覆盖率为92 %~96 %,同源性为99 % 以上,E 值为0,结合形态特征,可确认截获的德国蜗牛标本为上旋齿蜗牛Helicodonta obvoluta(Müller,1774)。

  3 结论和讨论

  本文对福建出入境检验检疫局从德国进境废塑料中截获的蜗牛标本开展了贝壳形态、软体解剖和分子生物学研究,结果表明截获的蜗牛物种为上旋齿蜗牛,系国内口岸首次截获。该蜗牛不但严重危害园艺作物,而且传播人畜共患寄生虫病,在我国大陆尚无分布,因此,建议有关部门加强对其检疫。

  上旋齿蜗牛同属的近似种有 H. angigyra(Rossmassler,1834)和H. wilhelminae Maassen,1991。其中,H. wilhelminae 仅分布于希腊的克里特岛,一般不易与上旋齿蜗牛误鉴,而H. angigyra 虽然分布范围较窄,但与上旋齿蜗牛分布区有重叠,在实际检疫工作中易误鉴。上旋齿蜗牛与其他两者的主要鉴别特征列于表1。

表 1 齿蜗牛属近似种鉴别特征的比较

  经典的陆生软体动物分类体系主要是基于贝壳形态和极少量代表种的解剖特征建立起来的,但是上旋齿蜗牛科的贝壳可用来作为分类鉴定的特征比较少,而且又常因为环境或地理的差异而产生变异,因此多半无法给予一个客观分类鉴定标准。在实际的检疫工作中,也往往难以获得典型的标本,如送鉴的标本为幼体或不成熟时,形态鉴定就显得十分困难,饲养为成螺再进行鉴定则更不可能(受检测周期的限制)。PCR 技术在国境口岸基层检验检疫部门已经普及,该检测鉴定技术以生物基因组DNA 序列比对为基本依据,具有检测周期短、特异性强、灵敏度高等特点。目前,无脊椎动物已有公认的线粒体COI 基因通用引物,技术成熟,受检测有害生物形态变异、成熟度等方面的影响较小(施伟, 2005),特别适合于贝壳形态变异较大的陆生软体动物等检疫性有害生物的快速检测鉴定。本研究将传统的形态学和现代分子生物学相结合,可确保鉴定结果的准确可靠,从而提升国境口岸陆生软体动物的整体检测能力。

  (原载于《自然博物》第4卷,第34-38页)

 
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